Hauptunterschied - PCR vs. DNA-Sequenzierung
PCR und DNA-Sequenzierung sind zwei wichtige Techniken in der Molekularbiologie. Die Polymerasekettenreaktion (PCR) ist der Prozess, bei dem eine große Anzahl von Kopien eines DNA-Fragments erstellt wird. Die DNA-Sequenzierung ist die Technik, die zur genauen Reihenfolge der Nukleotide eines bestimmten DNA-Fragments führt. Dies ist der Hauptunterschied zwischen PCR und DNA-Sequenzierung. Die PCR ist einer der Hauptschritte bei der DNA-Sequenzierung.
INHALT
1. Überblick und Hauptunterschied
2. Was ist PCR
? 3. Was ist DNA-Sequenzierung?
4. Vergleich nebeneinander - PCR vs. DNA-Sequenzierung
5. Zusammenfassung
Was ist PCR?
Die Polymerasekettenreaktion (PCR) ist eine in der Molekularbiologie verwendete DNA-Amplifikationstechnik. Es produziert Tausende bis Millionen Kopien eines bestimmten DNA-Fragments. Diese Methode wurde 1983 von Kary Mullis entwickelt. Bei dieser Technik dient das zu amplifizierende DNA-Fragment als Matrize, und das DNA-Polymeraseenzym fügt dem Primer, der in der PCR-Mischung verfügbar ist, komplementäre Nukleotide hinzu. Am Ende der PCR-Reaktion werden viele Kopien der Proben-DNA synthetisiert.
Es gibt verschiedene Komponenten des PCR-Gemisches, einschließlich DNA, DNA-Polymerase (Taq-Polymerase), Primer (Vorwärts- und Rückwärtsprimer), Nukleotide (Bausteine der DNA) und einen Puffer. Die PCR findet in einem PCR-Gerät statt, und die richtige PCR-Mischung sollte in das Gerät geladen und das richtige Programm gesteuert werden. Diese Technik ermöglicht die Herstellung von Tausenden bis Millionen Kopien eines bestimmten DNA-Abschnitts aus einer sehr kleinen DNA-Menge.
PCR-Reaktionen finden zyklisch statt, um die sichtbare Menge an PCR-Produkten auf einem Gel zu erzeugen. An einer PCR-Reaktion sind drei Hauptschritte beteiligt, nämlich Denaturierung, Primer-Annealing und Strangverlängerung, wie in Abbildung 01 gezeigt. Diese drei Schritte finden bei drei verschiedenen Temperaturen statt. DNA existiert in doppelsträngiger Form durch Wasserstoffbrücken zwischen den komplementären Basen. Vor der Implikation sollte doppelsträngige DNA voneinander getrennt werden. Dies geschieht durch Abgabe einer hohen Temperatur. Bei hoher Temperatur denaturieren doppelsträngige DNA in Einzelstränge. Dann sollten sich die Primer den flankierenden Enden des spezifischen Fragments oder des Gens der DNA nähern. Der Primer ist ein kurzes Stück einzelsträngiger DNA, das zur Zielsequenz komplementär ist. Vorwärts- und Rückwärtsprimer glühen mit den komplementären Basen an den flankierenden Enden der denaturierten Proben-DNA bei der Annealingtemperatur. Grundierungen sollten hitzebeständig sein. Sobald die Primer mit der Proben-DNA annelieren, initiiert das Taq-Polymerase-Enzym die Synthese der neuen Stränge durch Zugabe von Nukleotiden, die zur Ziel-DNA komplementär sind. Taq-Polymerase ist ein hitzestabiles Enzym, das aus einem thermophilen Bakterium namens Thermus aquaticus isoliert wurde. Der PCR-Puffer hält die optimalen Bedingungen für die Taq-Polymerase-Wirkung aufrecht. Diese drei Stufen der PCR-Reaktionen werden wiederholt, um die erforderliche Menge an PCR-Produkt zu erzeugen. Nach jeder PCR-Reaktion wird die Anzahl der DNA-Kopien verdoppelt. Daher kann bei der PCR eine exponentielle Amplifikation beobachtet werden. PCR-Produkte können mittels Gelelektrophorese beobachtet und für weitere Untersuchungen gereinigt werden.
Abbildung 01: Hauptschritte einer PCR-Reaktion
Die PCR ist ein wertvolles Instrument in der medizinischen und biologischen Forschung. Die PCR hat in der Forensik einen besonderen Wert, da sie DNA für Studien aus den winzigen Proben der Kriminellen amplifizieren und forensische DNA-Profile erstellen kann. PCR ist in vielen Bereichen der Molekularbiologie weit verbreitet, einschließlich Genotypisierung, Klonen von Genen, Nachweis von Mutationen, DNA-Sequenzierung, DNA-Microarrays und Vaterschaftstests usw.
Abbildung 02: Polymerasekettenreaktion
Was ist DNA-Sequenzierung?
Die DNA-Sequenzierung ist die Bestimmung einer genauen Reihenfolge der Nukleotide - Adenin, Guanin, Cytosin und Thymin in einem bestimmten DNA-Fragment. Genetische Informationen werden in den DNA-Sequenzen in der richtigen Reihenfolge der Nukleotide gespeichert. Daher ist es sehr wichtig, die genaue Reihenfolge der Nukleotide in einem DNA-Fragment zu finden, um die Struktur und Funktion der Gene zu kennen.
Das DNA-Sequenzierungsprotokoll beinhaltet verschiedene Prozesse. Der erste Schritt ist die Isolierung interessierter DNA oder genomischer DNA eines Organismus. Unter Verwendung von PCR (wie oben beschrieben) sollte die gewünschte Region der DNA amplifiziert werden. Das amplifizierte PCR-Produkt sollte durch Gelelektrophorese aufgetrennt und gereinigt werden. Amplifizierte Fragmente dienen als Matrizen für die Sequenzierung. Die Sequenzierung kann entweder nach der Sanger-Sequenzierung oder nach der Hochdurchsatz-Sequenzierungsmethode erfolgen. Die Sanger-Sequenzierung erfordert eine Kapillarelektrophorese der resultierenden DNA-Fragmente. Die Bestimmung der korrekten Nukleotidreihenfolge kann durch manuelles Ablesen von Autoradiographien oder unter Verwendung automatisierter DNA-Sequenzierer erfolgen.
Die Gensequenzierung trug zum Humangenomprojekt bei und erleichterte 2003 die Kartierung des Humangenoms. In der Forensik ermöglichte die DNA-Sequenzierung die Identifizierung von Personen, die einzigartige DNA-Sequenzen aufweisen und die Kriminellen identifizieren. In der Medizin kann die DNA-Sequenzierung verwendet werden, um die für genetische und andere Krankheiten verantwortlichen Gene zu erkennen, defekte Gene zu finden und durch korrekte Gene zu ersetzen. In der Landwirtschaft werden DNA-Sequenzierungsinformationen einiger Mikroorganismen verwendet, um transgene Pflanzen mit wirtschaftlich gewünschten Eigenschaften zu produzieren.
Abbildung 03: DNA-Sequenzierung
Was ist der Unterschied zwischen PCR und DNA-Sequenzierung?
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PCR vs DNA-Sequenzierung |
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| Der PCR-Prozess erzeugt Tausende bis Millionen Kopien des interessierten DNA-Fragments. | Bei der DNA-Sequenzierung wird die genaue Reihenfolge der Nukleotide in einem bestimmten DNA-Fragment bestimmt. |
| Ergebnis | |
| Die PCR erzeugt Tausende bis Millionen Kopien eines bestimmten DNA-Fragments | Dies führt zur richtigen Reihenfolge der Basen in einem bestimmten DNA-Fragment. |
| Beteiligung von ddNTPs | |
| Für die PCR sind keine ddNTPs erforderlich. Es werden dNTPs verwendet. | Die DNA-Sequenzierung erfordert ddNTPs, um die Strangbildung zu beenden. |
Zusammenfassung - PCR vs DNA-Sequenzierung
PCR und DNA-Sequenzierung sind in vielen Bereichen der Molekularbiologie sehr wichtige Werkzeuge. Die Amplifikation der DNA-Fragmente erfolgt durch die PCR-Technik, während die korrekte Reihenfolge der Nukleotide eines DNA-Fragments durch die DNA-Sequenzierung bestimmt wird. Dies ist der Unterschied zwischen PCR und DNA-Sequenzierung.
