Hauptunterschied - Sanger-Sequenzierung vs. Pyrosequenzierung
Die DNA-Sequenzierung ist für die DNA-Analyse sehr wichtig, da die Kenntnis der richtigen Nukleotidanordnung in einer bestimmten DNA-Region viele wichtige Informationen darüber liefert. Es gibt verschiedene DNA-Sequenzierungsmethoden. Sanger-Sequenzierung und Pyrosequenzierung sind zwei verschiedene DNA-Sequenzierungsmethoden, die in der Molekularbiologie weit verbreitet sind. Der Hauptunterschied zwischen Sanger-Sequenzierung und Pyrosequenzierung besteht darin, dass die Sanger-Sequenzierung Didesoxynukleotide verwendet, um die DNA-Synthese zum Lesen der Nukleotidsequenz zu beenden, während die Pyrosequenzierung die Pyrophosphatfreisetzung durch Einbau der Nukleotide und Synthese der komplementären Sequenz zum Lesen der genauen Reihenfolge der Sequenz erfasst.
INHALT
1. Überblick und Hauptunterschied
2. Was ist Sanger-Sequenzierung
? 3. Was ist Pyrosequenzierung?
4. Vergleich nebeneinander - Sanger-Sequenzierung und Pyrosequenzierung
5. Zusammenfassung
Was ist Sanger-Sequenzierung?
Die Sanger-Sequenzierung ist eine DNA-Sequenzierungsmethode der ersten Generation, die 1977 von Frederick Sanger und seinen Colleges entwickelt wurde. Sie wird auch als Kettenabbruchsequenzierung oder Didesoxy-Sequenzierung bezeichnet, da sie auf dem Kettenabbruch durch Didesoxynukleotide (ddNTPs) basiert. Diese Methode war mehr als 30 Jahre lang weit verbreitet, bis das New Generation Sequencing (NGS) entwickelt wurde. Die Sanger-Sequenzierungstechnik ermöglichte die Entdeckung der richtigen Nukleotidreihenfolge oder die Anlagerung eines bestimmten DNA-Fragments. Es basiert auf dem selektiven Einbau von ddNTPs und der Beendigung der DNA-Synthese während der In-vitro-DNA-Replikation. Das Fehlen von 3'-OH-Gruppen zur Fortsetzung der Bildung von Phosphodiesterbindungen zwischen benachbarten Nukleotiden ist ein einzigartiges Merkmal von ddNTPs. Sobald das ddNTP gebunden ist, hört die Kettenverlängerung auf und endet an diesem Punkt. Es gibt vier ddNTPs - ddATP, ddCTP, ddGTP und ddTTP -, die bei der Sanger-Sequenzierung verwendet werden. Diese Nukleotide stoppen den DNA-Replikationsprozess, wenn sie in den wachsenden DNA-Strang eingebaut werden, und führen zu unterschiedlichen Längen kurzer DNA. Die Kapillargelelektrophorese wird verwendet, um diese kurzen DNA-Stränge nach ihrer Größe auf einem Gel zu organisieren, wie in Abbildung 01 gezeigt.
1: Kapillargelelektrophorese von synthetisierter kurzer DNA
Für die In-vitro-Replikation von DNA sollten nur wenige Anforderungen gestellt werden. Sie sind DNA-Polymeraseenzym, Matrizen-DNA, Oligonukleotidprimer und Desoxynukleotide (dNTPs). Bei der Sanger-Sequenzierung wird die DNA-Replikation in vier separaten Reagenzgläsern zusammen mit vier Arten von ddNTPs separat durchgeführt. Desoxynukleotide werden nicht vollständig durch die jeweiligen ddNTPs ersetzt. Eine Mischung des bestimmten dNTP (zum Beispiel dATP + ddATP) ist in dem Röhrchen enthalten und wird repliziert. Vier separate Röhrchenprodukte werden in vier separaten Vertiefungen auf einem Gel laufen gelassen. Durch Lesen des Gels kann die Sequenz dann wie in Abbildung 02 dargestellt konstruiert werden.
Abbildung 02: Sanger-Sequenzierung
Die Sanger-Sequenzierung ist eine wichtige Technik, die in vielen Bereichen der Molekularbiologie hilfreich ist. Das Humangenomprojekt wurde mit Hilfe von Sanger-Sequenzierungsmethoden erfolgreich abgeschlossen. Die Sanger-Sequenzierung ist auch nützlich bei der Ziel-DNA-Sequenzierung, der Erforschung von Krebs und genetischen Krankheiten, der Genexpressionsanalyse, der Identifizierung des Menschen, dem Nachweis von Krankheitserregern, der mikrobiellen Sequenzierung usw.
Die Sanger-Sequenzierung hat mehrere Nachteile:
- Die Länge der zu sequenzierenden DNA darf nicht länger als 1000 Basenpaare sein
- Es kann jeweils nur ein Strang sequenziert werden.
- Der Prozess ist zeitaufwändig und teuer.
Daher wurden mit der Zeit neue fortschrittliche Sequenzierungstechniken entwickelt, um diese Probleme zu überwinden. Die Sanger-Sequenzierung wird jedoch aufgrund ihrer hochgenauen Ergebnisse bis zu Fragmenten mit einer Länge von ungefähr 850 Basenpaaren immer noch verwendet.
Was ist Pyrosequenzierung?
Pyrosequenzierung ist eine neuartige DNA-Sequenzierungstechnik, die auf der „Sequenzierung durch Synthese“basiert. Diese Technik beruht auf dem Nachweis der Pyrophosphatfreisetzung beim Einbau von Nukleotiden. Das Verfahren wird von vier verschiedenen Enzymen angewendet: DNA-Polymerse, ATP-Sulfurylase, Luciferase und Apyrase sowie zwei Substraten Adenosin-5'-Phosphosulfat (APS) und Luciferin.
Der Prozess beginnt mit der Primerbindung mit der einzelsträngigen DNA-Matrize und die DNA-Polymerase beginnt mit dem Einbau von dazu komplementären Nukleotiden. Wenn sich die Nukleotide verbinden (Nukleinsäurepolymerisation), werden Pyrophosphatgruppen (zwei miteinander verbundene Phosphatgruppen) und Energie freigesetzt. Jede Nukleotidaddition setzt eine äquimolare Menge Pyrophosphat frei. Pyrophosphat wandelt sich durch ATP-Sulfurylase in Gegenwart von Substrat APS in ATP um. Das erzeugte ATP treibt die Luciferase-vermittelte Umwandlung von Luciferin zu Oxyluciferin an und erzeugt sichtbares Licht in Mengen, die proportional zur Menge der ATPs sind. Licht wird von einem Photonendetektionsgerät oder einem Photovervielfacher erfasst und erzeugt ein Pyrogramm. Apyrase baut ATP und nicht eingebaute dNTPs im Reaktionsgemisch ab. Die dNTP-Addition erfolgt jeweils einmal. Da die Zugabe von Nukleotid nach Einbau und Nachweis von Licht bekannt ist, kann die Sequenz der Matrize bestimmt werden. Pyrogramm wird zur Erzeugung der Nukleotidsequenz der Proben-DNA verwendet, wie in Abbildung 03 gezeigt.
Die Pyrosequenzierung ist sehr wichtig bei der Analyse des Polymorphismus einzelner Nukleotide und der Sequenzierung kurzer DNA-Abschnitte. Die hohe Genauigkeit, Flexibilität, einfache Automatisierung und parallele Verarbeitung sind die Vorteile der Pyrosequenzierung gegenüber Sanger-Sequenzierungstechniken.
Abbildung 03: Pyrosequenzierung
Was ist der Unterschied zwischen Sanger-Sequenzierung und Pyrosequenzierung?
Diff Artikel Mitte vor Tabelle
Sanger-Sequenzierung vs Pyrosequenzierung |
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| Die Sanger-Sequenzierung ist eine DNA-Sequenzierungsmethode, die auf dem selektiven Einbau von ddNTPs durch DNA-Polymerase und Kettenabbruch basiert. | Pyrosequenzierung ist eine DNA-Sequenzierungsmethode, die auf dem Nachweis der Pyrophosphatfreisetzung beim Einbau von Nukleotid basiert. |
| Verwendung von ddNTP | |
| ddNTPs werden verwendet, um die DNA-Replikation zu beenden | ddNTPs werden nicht verwendet. |
| Beteiligte Enzyme | |
| DNA-Polymerase werden verwendet. | Es werden vier Enzyme verwendet: DNA-Polymerase, ATP-Sulfurylase, Luciferase und Apyrase. |
| Verwendete Substrate | |
| APS und Luciferin werden nicht verwendet. | Adenosin-5'-phosphosulfat (APS) und Luciferin werden verwendet. |
| Maximale Temperatur | |
| Dies ist ein langsamer Prozess. | Dies ist ein schneller Prozess. |
Zusammenfassung - Sanger Sequencing vs Pyrosequencing
Sanger-Sequenzierung und Pyrosequenzierung sind zwei in der Molekularbiologie verwendete DNA-Sequenzierungsmethoden. Die Sanger-Sequenzierung konstruiert die Reihenfolge der Nukleotide nacheinander durch Beendigung der Kettenverlängerung, während die Pyrosequenzierung die genaue Reihenfolge der Nukleotide nacheinander durch Einbau von Nukleotiden und Nachweis der Freisetzung von Pyrophosphaten konstruiert. Daher besteht der Hauptunterschied zwischen Sanger-Sequenzierung und Pyrosequenzierung darin, dass die Sanger-Sequenzierung bei der Sequenzierung durch Kettenabbruch arbeitet, während die Pyrosequenzierung bei der Sequenzierung durch Synthese arbeitet.
