Hauptunterschied - NGS vs Sanger-Sequenzierung
Next Generation Sequencing (NGS) und Sanger Sequencing sind zwei Arten von Nukleotidsequenzierungstechniken, die im Laufe der Zeit entwickelt wurden. Die Sanger-Sequenzierungsmethode war viele Jahre lang weit verbreitet, und NGS ersetzte sie kürzlich aufgrund ihrer Vorteile. Der Hauptunterschied zwischen NGS und Sanger-Sequenzierung besteht darin, dass NGS nach dem Prinzip arbeitet, Millionen von Sequenzen gleichzeitig schnell durch ein Sequenzierungssystem zu sequenzieren, während die Sanger-Sequenzierung nach dem Prinzip der Kettenbeendigung aufgrund des selektiven Einbaus von Didesoxynukleotiden durch das DNA-Polymeraseenzym arbeitet während der DNA-Replikation und der daraus resultierenden Fragmenttrennung durch Kapillarelektrophorese.
INHALT
1. Überblick und Hauptunterschied
2. Was ist die Nukleotidsequenzierung
? 3. Was ist NGS
? 4. Was ist die Sanger-Sequenzierung?
5. Vergleich nebeneinander - NGS- und Sanger-Sequenzierung.
6. Zusammenfassung
Was ist Nukleotidsequenzierung?
Genetische Informationen werden in den Nukleotidsequenzen der DNA oder RNA eines Organismus gespeichert. Der Prozess der Bestimmung der korrekten Reihenfolge von Nukleotiden (unter Verwendung von vier Basen) in einem gegebenen Fragment (in einem Gen, einem Cluster von Genen, einem Chromosom und einem vollständigen Genom) ist als Nukleotidsequenzierung bekannt. In Genomstudien, forensischen Studien, Virologie, biologischer Systematik, medizinischer Diagnose, Biotechnologie und in vielen anderen Bereichen ist es sehr wichtig, die Struktur und Funktion von Genen zu analysieren. Es gibt verschiedene Arten von Sequenzierungsmethoden, die von Wissenschaftlern entwickelt wurden. Unter diesen war die 1977 von Frederick Sanger entwickelte Sanger-Sequenzierung weit verbreitet und wurde lange Zeit populär gemacht, bis die Next Generation Sequencing sie ersetzte.
Was ist NGS?
Next Generation Sequencing (NGS) ist ein Begriff, der für moderne Sequenzierungsprozesse mit hohem Durchsatz verwendet wird. Es beschreibt eine Reihe verschiedener moderner Sequenzierungstechnologien, die die Genomforschung und die Molekularbiologie revolutionierten. Diese Techniken sind Illumina-Sequenzierung, Roche 454-Sequenzierung, Ionenprotonen-Sequenzierung und SOLiD-Sequenzierung (Sequenzierung durch Oligo Ligation Detection). NGS-Systeme sind schneller und billiger. In NGS-Systemen werden nämlich vier Haupt-DNA-Sequenzierungsmethoden verwendet; Pyrosequenzierung, Sequenzierung durch Synthese, Sequenzierung durch Ligation und Ionenhalbleitersequenzierung. Eine große Anzahl von DNA- oder RNA-Strängen (Millionen von) kann parallel sequenziert werden. Es ermöglicht die Sequenzierung des gesamten Genoms von Organismen innerhalb kurzer Zeit, im Gegensatz zur Sanger-Sequenzierung, die mehr Zeit in Anspruch nimmt.
NGS hat viele Vorteile gegenüber der herkömmlichen Sequenzierungs-Sanger-Methode. Es ist ein schneller, genauerer und kostengünstigerer Prozess, der mit einer kleinen Stichprobengröße durchgeführt werden kann. NGS kann in metagenomischen Studien, zum Nachweis von Variationen innerhalb eines einzelnen Genoms aufgrund von Insertionen und Deletionen usw. und zur Analyse von Genexpressionen verwendet werden.
Abbildung 1: Entwicklungen in der NGS-Sequenzierung
Was ist Sanger-Sequenzierung?
Die Sanger-Sequenzierung ist eine Sequenzierungsmethode, die 1977 von Frederick Sanger und seinen Kollegen entwickelt wurde, um die genaue Nukleotidreihenfolge eines bestimmten DNA-Fragments zu bestimmen. Es ist auch als Kettenabbruchsequenzierung oder Didesoxysequenzierung bekannt. Das Arbeitsprinzip dieser Methode ist die Beendigung der Strangsynthese durch selektiven Einbau von kettenterminierenden Didesoxynukleotiden (ddNTPs) wie ddGTP, ddCTP, ddATP und ddTTP durch DNA-Polymerase während der Replikation von DNA. Normale Nukleotide haben 3'-OH-Gruppen zur Bildung einer Phosphodiesterbindung zwischen benachbarten Nukleotiden, um die Strangbildung fortzusetzen. DdNTPs fehlt jedoch diese 3'-OH-Gruppe und sie können keine Phosphodiesterbindungen zwischen Nukleotiden bilden. Daher wird die Kettenverlängerung beendet.
Bei diesem Verfahren dient die zu sequenzierende einzelsträngige DNA als Matrizenstrang für die In-vitro-DNA-Synthese. Andere Anforderungen sind Oligonukleotidprimer, Desoxynukleotidvorläufer und DNA-Polymeraseenzym. Wenn die flankierenden Enden des Zielfragments bekannt sind, können Primer leicht für die DNA-Replikation entworfen werden. Vier getrennte DNA-Synthesereaktionen werden in vier getrennten Röhrchen durchgeführt. Jede Röhre hat separate ddNTPs, zusammen mit anderen Anforderungen. Aus dem jeweiligen Nukleotid wird eine Mischung aus dNTPs und ddNTPs zugegeben. Ebenso werden vier getrennte Reaktionen in vier Röhrchen mit vier Gemischen durchgeführt. Nach den Reaktionen werden der Nachweis von DNA-Fragmenten und die Umwandlung des Fragmentmusters in Sequenzinformationen durchgeführt. Die resultierenden DNA-Fragmente werden hitzedenaturiert und durch Gelelektrophorese getrennt. Wenn radioaktive Nukleotide verwendet werden, kann das Bandenmuster im Polyacrylamidgel durch Autoradiographie sichtbar gemacht werden. Wenn dieses Verfahren die fluoreszenzmarkierten Didesoxynukleotide verwendet, kann es im abgelesenen Gel gemildert und durch einen Laserstrahl geleitet werden, der vom fluoreszierenden Detektor erfasst wird. Um Fehler zu vermeiden, die auftreten können, wenn eine Sequenz vom Auge gelesen und manuell in einen Computer eingegeben wird, wurde diese Methode zur Verwendung eines automatisierten Sequenzers entwickelt, der mit dem Computer gekoppelt ist. Um Fehler zu vermeiden, die auftreten können, wenn eine Sequenz vom Auge gelesen und manuell in einen Computer eingegeben wird, wurde diese Methode zur Verwendung eines automatisierten Sequenzers entwickelt, der mit dem Computer gekoppelt ist. Um Fehler zu vermeiden, die auftreten können, wenn eine Sequenz vom Auge gelesen und manuell in einen Computer eingegeben wird, wurde diese Methode zur Verwendung eines automatisierten Sequenzers entwickelt, der mit dem Computer gekoppelt ist.
Dies ist die Methode zur Sequenzierung von DNA aus dem Humangenomprojekt. Diese Methode wird bei erweiterten Modifikationen immer noch verwendet, da sie trotz eines teuren und langsamen Prozesses genaue Sequenzinformationen liefert.
Abbildung_2: Sanger-Sequenzierung
Was ist der Unterschied zwischen NGS und Sanger Sequencing?
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NGS vs Sanger Sequenzierung |
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| Next Generation Sequencing (NGS) beziehen sich auf moderne Sequenzierungsprozesse mit hohem Durchsatz. Es beschreibt eine Reihe verschiedener moderner Sequenzierungstechnologien | Die Sanger-Sequenzierung ist eine von Frederick Sanger entwickelte Sequenzierungsmethode zur Bestimmung der genauen Nukleotidreihenfolge eines bestimmten DNA-Fragments. |
| Kosteneffektivität | |
| NGS ist ein billigeres Verfahren, da es Zeit, Arbeitskraft und Chemikalien reduziert. | Dies ist ein kostspieliger Prozess, da Zeit, Arbeitskraft und mehr Chemikalien erforderlich sind. |
| Geschwindigkeit | |
| Dies ist schneller, da sowohl die chemische Detektion als auch die Signaldetektion vieler Stränge parallel erfolgen. | Dies ist zeitaufwändig, da die chemische Detektion und die Signaldetektion als zwei separate Prozesse erfolgen und jeweils nur am Strang gelesen werden können. |
| Verlässlichkeit | |
| NGS ist zuverlässig. | Die Sanger-Sequenzierung ist weniger zuverlässig |
| Probengröße | |
| NGS benötigt weniger DNA. | Diese Methode benötigt eine große Menge an Template-DNA. |
| DNA-Basen pro sequenziertem Fragment | |
| Die Anzahl der DNA-Basen pro sequenziertem Fragment ist geringer als bei der Sanger-Methode | Generierungssequenzen sind länger als NGS-Sequenzen. |
Zusammenfassung - NGS vs Sanger Sequencing
NGS und Sanger-Sequenzierung sind Nukleotidsequenzierungstechniken, die in der Molekularbiologie häufig verwendet werden. Die Sanger-Sequenzierung ist eine frühe Sequenzierungsmethode, die durch NGS ersetzt wurde. Der Hauptunterschied zwischen NGS und Sanger-Sequenzierung besteht darin, dass NGS ein schneller, genauerer und kostengünstigerer Prozess als die Sanger-Sequenzierung ist. Beide Techniken führten zu großen Ausbrüchen in der Genetik und Biotechnologie.
