Hauptunterschied - Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing
Nukleotide sind die grundlegenden Struktureinheiten und Bausteine der DNA. Das DNA-Molekül besteht aus einer Polynukleotidkette. Es gibt vier verschiedene Nukleotide in der DNA. Diese Nukleotide bestehen aus vier verschiedenen stickstoffhaltigen Basen mit den Namen A (Adenin), G (Guanin), C (Cytosin), T (Thymin). Die Reihenfolge der Nukleotide im DNA-Molekül ist von großer Bedeutung, da sie eine wichtige genetische Information für das Wachstum und die Entwicklung von Organismen codiert. DNA-Sequenzierung bezieht sich auf den Prozess, der die genaue Nukleotidsequenz der DNA bestimmt. Es gibt verschiedene DNA-Sequenzierungsmethoden. Maxam Gilbert-Sequenzierung und Sanger-DNA-Sequenzierung sind zwei Methoden der DNA-Sequenzierung, die zur Sequenzierung der ersten Generation gehören. Das Maxam-Gilbert-Sequenzierungsverfahren bestimmt die Basensequenz durch chemische Spaltung der 5'-endmarkierten DNA-Fragmente, bevorzugt an jedem der vier Nukleotide und Gelelektrophorese. Das Sanger-Sequenzierungsverfahren bestimmt die Nukleotidsequenz durch Synthese einzelsträngiger DNA unter Verwendung von DNA-Polymerase und Didesoxynukleotiden und Gelelektrophorese. Dies ist der Hauptunterschied zwischen Maxam Gilbert und Sanger Sequencing.
INHALT
1. Überblick und Hauptunterschied
2. Was ist Maxam Gilbert
? 3. Was ist Sanger-Sequenzierung?
4. Vergleich nebeneinander - Maxam Gilbert vs. Sanger-Sequenzierung
5. Zusammenfassung
Was ist Maxam Gilbert-Sequenzierung?
Die Maxam-Gilbert-Sequenzierung, auch als chemische Sequenzierungsmethode bekannt, ist eine Technik, die entwickelt wurde, um die Reihenfolge der Nukleotide in der DNA zu bestimmen. Diese Methode wurde 1976 von Walter Gilbert und Alan Maxam eingeführt und wurde populär, da sie direkt mit gereinigter DNA durchgeführt werden kann. Die Maxam-Gilbert-Methode gehört zur ersten Generation der DNA-Sequenzierung und war die erste von Wissenschaftlern weit verbreitete Sequenzierungsmethode.
Das Grundprinzip dieser Methode liegt in der Beschränkung der endmarkierten DNA-Fragmente an bestimmten Basen durch basenspezifische Chemikalien und Bedingungen und der Trennung der markierten Fragmente durch Elektrophorese, wie in Abbildung 01 gezeigt. Die Fragmente werden entsprechend ihrer Größe auf der Gel. Da die Fragmente markiert sind, kann die Sequenz des DNA-Moleküls leicht abgeleitet werden.
Die Maxam-Gilbert-Methode verwendet basenspezifische Chemikalien, um DNA an bestimmten Basen zu brechen. Zwei übliche Chemikalien, Dimethylsulfat- und Hydrazinchemikalien genannt, werden verwendet, um Purine bzw. Pyrimidine selektiv anzugreifen.
Das Maxam Gilbert-Sequenzierungsverfahren wird in mehreren Schritten wie folgt durchgeführt.
- Reinigung der DNA-Sequenz unter Verwendung von Restriktionsendonukleasen
- Markierung der Enden der DNA-Fragmente durch Zugabe radioaktiver Phosphate
- Reinigung der markierten Fragmente aus nicht markierten Fragmenten durch Gelelektrophorese
- Trennung der endmarkierten DNA in vier Röhrchen und getrennte Behandlung mit basenspezifischen Chemikalien
- Elektrophorese des Inhalts jedes Röhrchens in getrennten Linien auf einem Gel und Fragmenttrennung entsprechend ihrer Länge.
- Nachweis der Fragmente durch Autoradiographie.
Abbildung 01: Maxam Gilbert-Sequenzierung
Was ist Sanger-Sequenzierung?
Sanger Sequencing ist eine Sequenzierungsmethode, die 1977 von Frederick Sanger und seinen Kollegen entwickelt wurde, um die Basensequenz eines bestimmten DNA-Fragments zu bestimmen. Es ist auch als Kettenabbruchsequenzierung oder Didesoxysequenzierungsverfahren bekannt. Diese Methode arbeitet nach dem Prinzip des selektiven Einbaus von kettenterminierenden Didesoxynukleotiden (ddNTPs) wie ddGTP, ddCTP, ddATP und ddTTP durch DNA-Polymerase während der Synthese von einzelsträngiger DNA zur Beendigung der Strangbildung. Didesoxynukleotiden fehlen 3'-OH-Gruppen zur Bildung von Phosphodiesterbindungen mit benachbarten Nukleotiden. Daher stoppt die Strangbildung, sobald ein ddNTP während der Sanger-Sequenzierung in den neu gebildeten Strang eingebaut wird.
Bei diesem Verfahren werden vier separate DNA-Synthesereaktionen (PCR) in vier separaten Röhrchen mit einem Typ von ddNTP durchgeführt. Andere Anforderungen werden auch für die PCR-Röhrchen geliefert, einschließlich Primer, dNTPs, Taq-Polymerase, spezifische Bedingungen usw. Vier getrennte Reaktionen werden in vier Röhrchen mit vier Gemischen durchgeführt. Nach PCR-Reaktionen werden die resultierenden DNA-Fragmente hitzedenaturiert und durch Gelelektrophorese getrennt. Dann werden die Fragmente sichtbar gemacht, indem entweder ein markierter (radioaktiver oder fluoreszierender) Primer oder dNTPs verwendet werden, wie in 02 gezeigt.
Abbildung 02: Sanger-Sequenzierung
Was ist der Unterschied zwischen Maxam Gilbert und Sanger Sequencing?
Diff Artikel Mitte vor Tabelle
Maxam Gilbert gegen Sanger Sequenzierung |
|
| Die Maxam Gilbert-Sequenzierung ist die erste Technik, die für die DNA-Sequenzierung entwickelt wurde. | Die Sanger-Sequenzierungsmethode wurde nach der Maxam Gilbert-Sequenzierungsmethode eingeführt. |
| Verwendungszweck | |
| Diese Methode wird selten angewendet. | Die Sanger-Sequenzierung wird routinemäßig zur Sequenzierung verwendet. |
| Verwendung gefährlicher Chemikalien | |
| Es werden gefährliche Chemikalien verwendet. | Die Verwendung gefährlicher Chemikalien ist im Vergleich zur Maxam-Gilbert-Methode begrenzt. |
| Kennzeichnung zur Erkennung | |
| Dieses Verfahren verwendet radioaktives P 32 zum Markieren der Enden der DNA-Fragmente. | Bei der Sanger-Sequenzierung werden radioaktiv oder fluoreszenzmarkierte ddNTPs verwendet. |
Zusammenfassung - Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing
Maxam Gilbert- und Sanger-Sequenzierung sind zwei Arten von DNA-Sequenzierungstechniken, die unter die DNA-Sequenzierung der ersten Generation fallen. Die Maxam-Gilbert-Sequenzierung ist die erste Methode, die 1976 für die DNA-Sequenzierung eingeführt wurde. Sie wird durchgeführt, indem die endmarkierten DNA-Fragmente durch basenspezifische Chemikalien gebrochen werden. Daher ist es als chemische Sequenzierung bekannt. Die Sanger-Sequenzierungsmethode wurde 1977 eingeführt und basiert auf den ddNTP-gesteuerten Kettenabbruchreaktionen. Die Sanger-Sequenzierungsmethode ist aufgrund mehrerer Nachteile der Maxam Gilbert-Methode, wie übermäßiger Zeitverbrauch, Verwendung gefährlicher Chemikalien usw., beliebter als die Maxam Gilbert-Methode. Dies ist der Unterschied zwischen der Maxam Gilbert- und der Sanger-Sequenzierung.
