Hauptunterschied - Nick Translation vs Primer Extension
Nick-Translation und Primer-Extension sind zwei wichtige Techniken, die in der Molekularbiologie durchgeführt werden. Der Hauptunterschied zwischen Nick-Translation und Primer-Verlängerung besteht darin, dass der Nick-Translationsprozess markierte Sonden für andere Hybridisierungstechniken erzeugt, während die Primer-Verlängerungsmethode eine spezifische RNA-Sequenz aus einer Mischung identifiziert und Informationen über die Expression von mRNA enthüllt. Beide Techniken sind von großer Bedeutung und werden routinemäßig in molekularen Forschungslabors durchgeführt.
INHALT
1. Überblick und Hauptunterschied
2. Was ist Nick-Übersetzung
? 3. Was ist Primer-Erweiterung?
4. Vergleich nebeneinander - Nick-Übersetzung und Primer-Erweiterung
5. Zusammenfassung
Was ist Nick Translation?
Die Nick-Translation ist eine wichtige Technik zur Herstellung markierter Sonden für verschiedene molekularbiologische Techniken wie Blotting, In-situ-Hybridisierung, fluoreszierende In-situ-Hybridisierung usw. Sie ist eine In-vitro-Methode zur DNA-Markierung. DNA-Sonden werden verwendet, um spezifische DNA- oder RNA-Sequenzen zu identifizieren. Mit Hilfe einer markierten Sonde können bestimmte Fragmente aus einer komplexen Mischung von Nukleinsäuren markiert oder sichtbar gemacht werden. Daher werden markierte Sonden unter Verwendung verschiedener Techniken hergestellt, die für verschiedene Techniken verwendet werden sollen. Die Nick-Translation ist eine solche Methode, bei der markierte Sonden mit Hilfe der Enzyme DNase 1 und DNA-Polymerase 1 hergestellt werden.
Der Nick-Translationsprozess beginnt mit der DNase 1-Enzymaktivität. DNase 1 führt Kerben in das Phosphatrückgrat doppelsträngiger DNA ein, indem Phosphodiesterbindungen zwischen Nukleotiden gespalten werden. Sobald der Nick erzeugt ist, wird eine freie 3'-OH-Gruppe des Nukleotids erhalten und das Enzym DNA-Polymerase 1 wirkt darauf ein. Die 5'- bis 3'-Exonukleaseaktivität der DNA-Polymerase 1 entfernt Nukleotide vom Nick in Richtung der 3'-Richtung des DNA-Strangs. Gleichzeitig wirkt die Polymeraseaktivität des DNA-Polymerase-1-Enzyms und fügt Nukleotide hinzu, um die entfernten Nukleotide zu ersetzen. Wenn die Nukleotide markiert wurden, erfolgt der Ersatz durch die markierten Nukleotide und markiert die DNA zur Identifizierung. Diese neu synthetisierte markierte DNA kann als Sonde in verschiedenen Hybridisierungsreaktionen in der Molekularbiologie verwendet werden.
Abbildung 01: Nick-Übersetzungsprozess
Was ist Primer Extension?
Die Primerverlängerung ist eine Technik, die verwendet wird, um eine spezifische RNA-Sequenz aus einem RNA-Gemisch zu finden und das 5'-Ende des mRNA-Transkripts zu lokalisieren. Es wird auch verwendet, um die Struktur von RNA und Expression zu untersuchen. Das Primerverlängerungsverfahren wird mit markierten Primern oder mit markierten Nukleotiden durchgeführt. Wenn markierte Primer verwendet werden, schließt dies die Notwendigkeit der Markierung der Nukleotide aus, die für die Synthese von cDNA verwendet werden. Diese Technik besteht aus mehreren Schritten. Es beginnt mit der Extraktion von RNA aus der Probe. Dann wird ein markierter Oligonukleotidprimer zusammen mit den notwendigen Bestandteilen zu der Mischung gegeben, um die cDNA einer spezifischen RNA-Sequenz zu synthetisieren. Der Primer glüht mit der komplementären Sequenz aus der Mischung. Unter Verwendung der Primer-getemperten Sequenz als MatrizeDas Enzym Reverse Transkriptase synthetisiert die komplementäre DNA (cDNA) der RNA-Sequenz. Primer-Annealing und reverse Transkription treten nur auf, wenn die spezifische RNA-Sequenz in der Probe vorhanden ist. Wenn schließlich eine Denaturierungsgelelektrophorese durchgeführt wird, kann die Größe der RNA-Sequenz bestimmt werden. Es ist auch leicht, die + 1-Base der mRNA-Sequenz (Transkriptionsinitiationsstelle) durch die Primerverlängerungsmethode zu finden. Die Menge an in der Probe vorhandener mRNA kann durch dieses Verfahren quantifiziert werden, wenn überschüssiger Primer verwendet wird. Es ist auch leicht, die + 1-Base der mRNA-Sequenz (Transkriptionsinitiationsstelle) durch die Primerverlängerungsmethode zu finden. Die Menge an in der Probe vorhandener mRNA kann durch dieses Verfahren quantifiziert werden, wenn überschüssiger Primer verwendet wird. Es ist auch leicht, die + 1-Base der mRNA-Sequenz (Transkriptionsinitiationsstelle) durch die Primerverlängerungsmethode zu finden. Die Menge an in der Probe vorhandener mRNA kann durch dieses Verfahren quantifiziert werden, wenn überschüssiger Primer verwendet wird.
Abbildung 02: Primerverlängerung
Was ist der Unterschied zwischen Nick Translation und Primer Extension?
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Nick Translation vs Primer Extension |
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| Die Nick-Translation ist ein Prozess, bei dem markierte DNA-Sonden für verschiedene Hybridisierungsreaktionen erstellt werden. | Die Primerverlängerung ist eine Technik, die verwendet wird, um spezifische RNA zu finden oder die Genexpression zu untersuchen. |
| Verwendete Enzyme | |
| Es werden DNase 1- und DNA-Polymeraseenzyme verwendet. | Reverse Transkriptaseenzym wird verwendet. |
| Bedeutung | |
| Die Nick-Translation erleichtert die Markierung spezifischer DNA-Sequenzen. | Die Primerverlängerung ermöglicht den Nachweis der spezifischen mRNA-Sequenzgröße und der in der Probe vorhandenen Menge. |
Zusammenfassung - Nick Translation vs Primer Extension
Die Nick-Translation ist eine Methode zur Synthese markierter Sonden basierend auf den Aktivitäten der Enzyme DNase 1 und E coli DNA Polymerase 1. Es ist eine In-vitro-Methode, die in den Labors vor verschiedenen Hybridisierungstechniken angewendet wird. Während der Nick-Translation entfernt die 5'-3'-Exonukleaseaktivität der DNA-Polymerase 1 Nukleotide vor dem Nick und die Polymeraseaktivität der DNA-Polymerase 1 ersetzt die entfernten Nukleotide durch markierte Nukleotide hinter dem Nick. Die Primerverlängerung ist eine Methode, mit der ein spezifisches RNA-Transkript aus einer Mischung nachgewiesen und die Größe und Menge der interessierenden RNA quantifiziert wird. Dies ist der Unterschied zwischen Nick-Translation und Primer-Extension.
