Hauptunterschied - SYBR Green gegen Taqman
SYBR Green und Taqman sind zwei Methoden zum Nachweis oder zur Beobachtung des Amplifikationsprozesses von Echtzeit-PCR. SYBR Green ist eine Methode, die auf der Interkalation von Nukleinsäure-Färbefarbstoffen basiert, während Taqman eine Methode ist, die auf einer Hydrolysesonde basiert. Beide Technologien sind so konzipiert, dass sie während der PCR Fluoreszenz erzeugen, wodurch ein Echtzeit-PCR-Gerät die Reaktion in „Echtzeit“überwachen kann. Das SYBR Green-Verfahren wird unter Verwendung eines fluoreszierenden Farbstoffs namens SYBR green durchgeführt und detektiert die Amplifikation durch Bindung des Farbstoffs an produzierte doppelsträngige DNA. Taqman wird unter Verwendung von doppelt markierten Sonden durchgeführt und detektiert die Amplifikation durch Abbau der Sonde durch Taq-Polymerase und Freisetzung des Fluorophors. Dies ist der Hauptunterschied zwischen SYBR Green und Taqman.
INHALT
1. Überblick und Hauptunterschied
2. Was ist SYBR Green
3. Was ist Taqman?
4. Vergleich nebeneinander - SYBR Green vs Taqman
5. Zusammenfassung
Was ist SYBR Green?
SYBR Green ist ein fluoreszierender Farbstoff, der zur Färbung von Nukleinsäuren verwendet wird, insbesondere doppelsträngiger DNA in der Molekularbiologie. Die SYBR Green-Methode wird verwendet, um PCR-Produkte während der Echtzeit-PCR zu quantifizieren. Sobald es an DNA bindet, absorbiert der resultierende DNA-Farbstoffkomplex blaues Licht und sendet intensives grünes Licht aus. Dies geschieht aufgrund der Strukturänderung, die im Farbstoffmolekül bei der Bindung an doppelsträngige DNA auftritt. Wenn durch PCR immer mehr DNA erzeugt wird, binden mehr Farbstoffmoleküle an DNA und erzeugen mehr Fluoreszenz. Daher nimmt die Fluoreszenz mit der Akkumulation des PCR-Produkts zu. Daher kann die Menge an PCR-Produkt durch den SYBR Green-Fluoreszenznachweis quantitativ gemessen werden.
SYBR-Grünfarbstoff kann auch zur DNA-Markierung in der Zytometrie und Fluoreszenzmikroskopie verwendet werden. Ethidiumbromid wurde erfolgreich durch SYBR Green ersetzt, da Ethidiumbromid ein krebserregender Farbstoff mit Entsorgungsproblemen während der DNA-Visualisierung in der Gelelektrophorese ist.
Die SYBR-Green-Methode hat Vor- und Nachteile. Diese Methode ist sehr empfindlich, kostengünstig und einfach zu bedienen. Aufgrund seiner Fähigkeit, an doppelsträngige DNA zu binden, kann eine unspezifische Bindung jedoch zu einer Überquantifizierung des PCR-Produkts führen.
Abbildung 01: SYBR Green-Technik
Was ist Taqman?
Taqman ist eine alternative Methode zu SYBR Green, um den Echtzeit-PCR-Prozess zu überwachen. Diese Methode hängt von der 5'-3'-Exonukleaseaktivität des Taq-Polymeraseenzyms ab, um die Sonden während der Verlängerung des neuen Strangs und der Freisetzung von Fluorophor abzubauen. Bei dieser Methode werden doppelt markierte Sonden verwendet, die auf der Hydrolyse von Sonden basieren. Sonden sind fluoreszenzmarkierte DNA-Oligonukleotide mit einem fluoreszierenden Reportermolekül (Fluorophor) am 5'-Ende und einem Quencher-Molekül am 3'-Ende. Sie sind so konzipiert, dass sie an die einzelsträngige Matrize auf der gegenüberliegenden Seite des Primer-Anneals binden. Die Taq-Polymerase fügt dem Primer Nukleotide hinzu und verlängert den neuen Strang in Richtung der doppelt markierten Sonden. Sobald die Taq-Polymerase auf die Sonde trifft, aktiviert und baut die Exonukleasewirkung der Taq-Polymerase die Sonde ab. Sobald die Synthese des neuen Strangs abgeschlossen ist, wird die Sonde vollständig abgebaut und setzt das Fluorophor frei. Die Freisetzung von Fluorophor erzeugt Fluoreszenz. Das fluoreszierende Quencher-Molekül löscht das emittierte Licht effizient und erzeugt die Ausgabe zur Quantifizierung des PCR-Produkts. Die Freisetzung von Fluorophoren und die Menge der PCR-Produkte sind proportional. Daher kann die Quantifizierung leicht durch die Taqman-Methode durchgeführt werden. Die Quantifizierung kann leicht mit der Taqman-Methode erfolgen. Die Quantifizierung kann leicht mit der Taqman-Methode erfolgen.
Abbildung 02: Taqman-Methode
Die Taqman-Methode wird in der Echtzeit-PCR, der Quantifizierung der Genexpression, dem Nachweis genetischer Polymorphismen, der Quantifizierung chromosomaler DNA-Deletionen, der Identifizierung von Bakterien, der Überprüfung der Microarray-Analyse, der SNP-Genotypisierung usw. verwendet.
Was ist der Unterschied zwischen SYBR Green und Taqman?
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SYBR Green gegen Taqman |
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| SYBR Green basiert auf DNA-Bindungsfarbstoff. | Taqman hängt von Hybridisierungssonden und der 5'- bis 3'-Exonukleaseaktivität der Taq-Polymerase ab. |
| Fluoreszenzmarkierte Sonden | |
| Es sind keine fluoreszenzmarkierten Sonden erforderlich. | Es sind doppelt markierte Sonden erforderlich. |
| Multiplex-Genanalyse | |
| Es kann nicht für Multiplex-Genziele verwendet werden. | Es kann für Multiplex-Genziele verwendet werden. |
| Kosten | |
| Das ist günstiger. | Das ist teurer. |
| Spezifität | |
| Dies ist weniger spezifisch und bindet an jede Doppelstrang-DNA | Diese sind hochspezifisch, da Sonden die spezifischen Amplifikationsprodukte nachweisen. |
| Wirksamkeit | |
| Dies ist weniger effektiv. | Dies ist sehr effektiv. |
| Anwendung | |
| Dies wird in Echtzeit-PCR, Agarosegel-Visualisierung, DNA-Markierung usw. verwendet. | Dies wird bei der Echtzeit-PCR, der Quantifizierung der Genexpression, dem Nachweis genetischer Polymorphismen usw. verwendet. |
Zusammenfassung - SYBR Green und Taqman
Taqman und SYBR green sind zwei Methoden, die in der Echtzeit-PCR (quantitative PCR) eingesetzt werden. Beide Methoden ermöglichen eine effiziente Quantifizierung des PCR-Produkts und beruhen auf der Emission der Fluoreszenz. Das Taqman-Verfahren verwendet doppelt markierte Sonden zum Nachweis der akkumulierten DNA, während das SYBR Green-Verfahren einen fluoreszierenden Farbstoff verwendet. Beide Methoden haben auch unterschiedliche Anwendungen in der Molekularbiologie.
