Hauptunterschied - Microarray vs. RNA-Sequenzierung
Das Transkriptom repräsentiert den gesamten Gehalt an RNA, der in einer Zelle vorhanden ist, einschließlich mRNA, rRNA, tRNA, abgebauter RNA und nicht abgebauter RNA. Das Profilieren des Transkriptoms ist ein wichtiger Prozess, um die Erkenntnisse der Zellen zu verstehen. Es gibt verschiedene fortgeschrittene Methoden zur Erstellung von Transkriptomprofilen. Microarray- und RNA-Sequenzierung sind zwei Arten von Technologien, die zur Analyse des Transkriptoms entwickelt wurden. Der Hauptunterschied zwischen Microarray- und RNA-Sequenzierung besteht darin, dass Microarray auf dem Hybridisierungspotential vordefinierter markierter Sonden mit Ziel-cDNA-Sequenzen basiert, während die RNA-Sequenzierung auf der direkten Sequenzierung von cDNA-Strängen durch fortschrittliche Sequenzierungstechniken wie NGS basiert. Microarray wird mit dem Vorwissen über die Sequenzen durchgeführt und die RNA-Sequenzierung wird ohne das Vorwissen über Sequenzen durchgeführt.
INHALT
1. Überblick und Hauptunterschied
2. Was ist Microarray
? 3. Was ist RNA-Sequenzierung?
4. Vergleich nebeneinander - Microarray- und RNA-Sequenzierung
5. Zusammenfassung
Was ist Microarray?
Microarray ist eine robuste, zuverlässige Methode mit hohem Durchsatz, die von Wissenschaftlern für die Transkriptomprofilierung verwendet wird. Dies ist der beliebteste Ansatz für die Transkriptanalyse. Es ist eine kostengünstige Methode, die von den Hybridisierungssonden abhängt.
Die Technik beginnt mit der Extraktion von mRNA aus der Probe und dem Aufbau einer cDNA-Bibliothek aus Gesamt-RNA. Dann wird es mit fluoreszenzmarkierten vorgefertigten Sonden auf einer festen Oberfläche (Punktmatrix) gemischt. Komplementäre Sequenzen hybridisieren mit den markierten Sonden im Microarray. Dann wird der Microarray gewaschen und gescreent, und das Bild wird quantifiziert. Die gesammelten Daten sollten analysiert werden, um die relativen Expressionsprofile zu erhalten.
Es wird angenommen, dass die Intensität der Microarray-Sonden proportional zur Menge der Transkripte in der Probe ist. Die Genauigkeit der Technik hängt jedoch von den entworfenen Sonden, dem Vorwissen über die Sequenz und der Affinität der Sonden zur Hybridisierung ab. Daher weist die Microarray-Technologie Einschränkungen auf. Die Microarray-Technik kann nicht mit Transkripten mit geringer Häufigkeit durchgeführt werden. Isoformen können nicht unterschieden und genetische Varianten nicht identifiziert werden. Da dieses Verfahren von der Hybridisierung von Sonden abhängt, treten bei der Microarray-Technik einige Probleme im Zusammenhang mit der Hybridisierung auf, wie z. B. Kreuzhybridisierung, unspezifische Hybridisierung usw.
Abbildung 01: Microarray
Was ist RNA-Sequenzierung?
Die RNA-Shotgun-Sequenzierung (RNA seq) ist eine kürzlich entwickelte Sequenzierungstechnik für das gesamte Transkriptom. Es ist eine schnelle und durchsatzstarke Methode zur Transkriptomprofilerstellung. Es quantifiziert direkt die Expression von Genen und führt zu einer eingehenden Untersuchung des Transkriptoms. Die RNA-Sequenz hängt nicht von vorgefertigten Sonden oder Vorkenntnissen der Sequenzen ab. Daher weist das RNA-seq-Verfahren eine hohe Empfindlichkeit und Fähigkeit zum Nachweis neuer Gene und genetischer Varianten auf.
Das RNA-Sequenzierungsverfahren wird in mehreren Schritten durchgeführt. Die Gesamt-RNA der Zelle muss isoliert und fragmentiert werden. Dann muss unter Verwendung der reversen Transkriptase eine cDNA-Bibliothek hergestellt werden. Jeder cDNA-Strang muss mit Adaptern ligiert werden. Dann müssen die ligierten Fragmente amplifiziert und gereinigt werden. Schließlich muss unter Verwendung einer NGS-Methode die Sequenzierung der cDNA durchgeführt werden.
Abbildung 02: RNA-Sequenzierung
Was ist der Unterschied zwischen Microarray- und RNA-Sequenzierung?
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Microarray vs RNA-Sequenzierung |
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| Microarray ist eine robuste, zuverlässige Methode mit hohem Durchsatz. | Die RNA-Sequenzierung ist eine genaue Methode mit hohem Durchsatz. |
| Kosten | |
| Dies ist eine kostengünstige Methode. | Dies ist eine teure Methode. |
| Analyse einer großen Anzahl von Proben | |
| Dies erleichtert die gleichzeitige Analyse einer großen Anzahl von Proben. | Dies erleichtert die Analyse einer großen Anzahl von Proben. |
| Datenanalyse | |
| Die Datenanalyse ist komplex. | Bei dieser Methode werden mehr Daten generiert. Daher ist der Prozess komplexer. |
| Vorkenntnisse von Sequenzen | |
| Diese Methode basiert auf Hybridisierungssonden, daher sind Vorkenntnisse der Sequenzen erforderlich. | Diese Methode hängt nicht von den vorherigen Sequenzkenntnissen ab. |
| Strukturvariationen und neuartige Gene | |
| Diese Methode kann keine strukturellen Variationen und neuartigen Gene nachweisen. | Dieses Verfahren kann strukturelle Variationen wie Genfusion, alternatives Spleißen und neuartige Gene erkennen. |
| Empfindlichkeit | |
| Dies kann keine Unterschiede in der Expression von Isoformen feststellen, so dass dies eine begrenzte Empfindlichkeit aufweist. | Dies hat eine hohe Empfindlichkeit. |
| Ergebnis | |
| Dies kann nur zu relativen Expressionsniveaus führen. Dies gibt keine absolute Quantifizierung der Genexpression. | Es gibt absolute und relative Expressionsniveaus. |
| Daten-Reanalyse | |
| Dies muss erneut ausgeführt werden, um erneut zu analysieren. | Sequenzierungsdaten können erneut analysiert werden. |
| Bedarf an spezifischem Personal und Infrastruktur | |
| Spezifische Infrastruktur und Personal sind für Microarray nicht erforderlich. | Spezifische Infrastruktur und Personal für die RNA-Sequenzierung. |
| Technische Probleme | |
| Die Microarray-Technik weist technische Probleme wie Kreuzhybridisierung, unspezifische Hybridisierung, begrenzte Nachweisrate einzelner Sonden usw. auf. | Die RNA-Sequenztechnik vermeidet technische Probleme wie Kreuzhybridisierung, unspezifische Hybridisierung, begrenzte Nachweisrate einzelner Sonden usw. |
| Vorurteile | |
| Dies ist eine voreingenommene Methode, da sie von der Hybridisierung abhängt. | Die Vorspannung ist im Vergleich zu Microarray gering. |
Zusammenfassung - Microarray vs RNA-Sequenzierung
Microarray- und RNA-Sequenzierungsmethoden sind Hochdurchsatzplattformen, die für die Transkriptomprofilierung entwickelt wurden. Beide Methoden liefern Ergebnisse, die stark mit Genexpressionsprofilen korrelieren. Die RNA-Sequenzierung hat jedoch Vorteile gegenüber dem Microarray für die Genexpressionsanalyse. Die RNA-Sequenzierung ist eine empfindlichere Methode zum Nachweis von Transkripten mit geringer Häufigkeit als Microarray. Die RNA-Sequenzierung ermöglicht auch die Unterscheidung zwischen Isoformen und die Identifizierung von Genvarianten. Microarray ist jedoch die übliche Wahl der meisten Forscher, da die RNA-Sequenzierung eine neue und teure Technik mit Herausforderungen bei der Datenspeicherung und komplexer Datenanalyse ist.
